Gel de filtración columnas se utilizan para separar las proteínas a partir de mezclas complejas. Puesto que cada proteína tiene un peso molecular único, que pueden ser inducidos a separarse en distintas capas mediante la migración de ellos a través de una filtración de la columna que contiene una matriz de gel distribuido uniformemente. Para identificar correctamente cada una proteína que se separa, se tendrá que calibrar las columnascon varias proteínas de peso molecular conocido.
CALIBRAR FILTRACIÓN
Lo que necesita
La anhidrasa carbónica
Citocromo C
La aprotinina
Sal Basal
Tubos de centrífuga
La ferritina
Centrifugar
Bomba de pipeta
250 ml probeta
Líquido tampón
Toallitas de limpieza Científicas
El cuerpo de jeringa
Retire los viales de la anhidrasa carbónica, el citocromo C y aprotinina de la nevera o en el congelador y deje que alcancen la temperatura ambiente. Añadir 4 mg de cada proteína a un tubo de centrífuga por mililitro de gel en la columna de la filtración. Agregar 961 mcl de sal basal por miligramo de proteína para cada tubo de centrífuga para disolver las proteínas. Añadir 39,2 mcl de ferritina por mililitro de gel a cada tubo y mezclar a continuación en una centrífuga.
Apague la bomba de la columna de filtración y cerrar la llave de paso en la entrada de la columna. Afloje, pero no quite, la parte superior de la columna de filtración. Establecer la bomba a la velocidad de flujo máxima para la columna y reinicie la bomba hasta que el material de tampón ha sido dibujado fuera. Parar la bomba.
Añadir 1 ml de cada proteína a la columna de filtración utilizando una bomba de pipeta. Goteo las proteínas por el interior de la columna desde una altura de 1 cm a 2 cm, de trabajo alrededor del borde interior de la columna. Dejar que la mezcla de proteínas se asiente en la parte superior de la matriz de gel.
Colocar el tubo de salida de la bomba en un lugar limpio, seco 250 ml de cilindro graduado. Reiniciar la bomba a una velocidad de 0,30 ml por minuto y ejecutar las proteínas en la matriz de gel. Mientras que la bomba está funcionando, enjuagar los lados del tubo usando la pipeta de la bomba y una pequeña cantidad de líquido tampón. Una vez que las proteínas han entrado completamente en la matriz de gel, reducir la velocidad de la bomba a 0,02 ml por minuto y la bomba en un 5 cm a 7 cm de capa de líquido tampón en la parte superior de la matriz.
Desconecte la tapa de la columna de la llave de paso. Limpiar la tapa de la columna y el interior de la columna usando toallitas de limpieza científicas. Vuelva a instalar la tapa de la columna. Llene el depósito de acumulación de líquido tampón. Conecte una jeringa a la llave y abrirla. Utilice la jeringa para extraer una pequeña cantidad de tampón a través del tubo y en la jeringa. Cierre la llave de paso y vuelva a colocarla en la cabeza de la columna. Abra la llave de paso y verifique que no haya fugas.
Ejecutar la columna a 0,02 ml por minuto durante varios días, hasta que la banda ferritina se acerca al final de la columna. Recoge toda la filtración en gel que se bombea en el cilindro graduado.
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